Quantifizierung von miRNA und sncRNA

Die genaue Quantifizierung von miRNA / sncRNA ist ein wichtiger Schritt, um das Potenzial von miRNA als Biomarker für Krankheiten voll auszuschöpfen

Der Einfluss von microRNAs (miRNAs) und anderer kurzer nichtkodierender RNA-Sequenzen (sncRNA) auf die Regulierung von Stoffwechselprozessen ist ein Thema aktueller Forschung. Ergebnisse zeigen, dass diese häufig vorkommenden RNAs entscheidend an der Steuerung vieler molekularen Signalwege (p53, Wnt, FAS und andere) beteiligt sind und damit ein hohes Potenzial als Biomarker für Krankheiten haben.

 

 

miRNA / sncRNA Quantifizierungsassays

 

Die genaue Mengenbestimmung der miRNA spielt dabei eine wichtige Rolle. Unser Partner BioVendor hat deshalb Quantifizierungsassays entwickelt, die miRNAs mit hoher Spezifität und Sensitivität nachweisen können. Die Quantifizierung der miRNA basiert dabei auf zwei innovativen Verfahren, einerseits der PCR-basierten Two-Tailed RT-qPCR und andererseits einem Verfahren, welches als miRNA enzyme immunoassay assay (miREIA) bezeichnet wird. Beide Verfahren liefern robuste Ergebnisse und sind einfach in der Anwendung.

 

 

Two-Tailed RT-qPCR

Die patentierte Two-Tailed RT-qPCR-Technologie mit einem einzigartigen Mechanismus von RT-Primern bietet im Vergleich zu anderen Methoden eine überlegene Leistung mit hervorragender Spezifität. Die Two-Tailed RT-qPCR ist für die Gesamtquantifizierung von miRNA und  piwi-interacting RNAs (piRNA) standardisiert.

Die Herausforderung beim Nachweis kleiner microRNAs besteht darin, dass zwei herkömmliche PCR-Primer nicht zum Ziel passen, da ihre kombinierte Länge fast doppelt so lang ist wie die der microRNA. Ältere Techniken haben dieses Problem gelöst, indem sie die microRNA z. B. mit einem Hairpin-Primer verlängert, einen Poly-A-Schwanz hinzugefügt oder ein Fragment durch Ligation hinzugefügt haben. Dies beeinträchtigt jedoch die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays, da nur einer der PCR-Primer die eigentliche microRNA-Sequenz erkennt; der andere erkennt die hinzugefügte Verlängerung. Außerdem lassen sich mit diesen Methoden keine am 3'-Ende modifizierten microRNAs nachweisen, da dies den Verlängerungsprozess stört.

Die Technologie wurde im TATAABiocenter entwickelt und von BioVendor gekauft. Die miRNA Two-Tailed RT-qPCR Assays bieten eine überlegene Lösung. Anstelle einer einzelnen Bindungssonde werden bei der Two-Tailed-PCR zwei Hemisonden verwendet, die an unterschiedliche Abschnitte der microRNA binden und durch ein gefaltetes Tether verbunden sind. Während jede Hemisonde zu kurz ist, um die microRNA zu binden, binden beide Hemisonden, wenn sie komplementär sind, gemeinsam. Die Bindung ist äußerst spezifisch, da eine Fehlanpassung bei einer kurzen Hemisonde viel stärker ausgeprägt ist. Die gebildete cDNA kann dann durch PCR mit zwei sequenzspezifischen Primern amplifiziert werden. SYBR wird zum Nachweis verwendet. Zum Nachweis unspezifischer Produkte kann eine Analyse mit hohem Schmelzpunkt durchgeführt werden.

 

 

 

miRNA enzyme immunoassay assay (miREIA )

 

miREIA ist ein neuartiges, auf einem Immunoassay basierendes Verfahren zur miRNA-Quantifizierung, das die Hybridisierung von aus einer Patientenprobe isolierter miRNA mit einer komplementären biotinylierten DNA-Oligonukleotid-Sonde umfasst. Die DNA/RNA-Hybride werden dann von einem in einer Mikrotiterplatte immobilisierten monoklonalen Antikörper eingefangen, der für perfekt abgestimmte DNA/miRNA-Hybride spezifisch ist. Die nächsten Schritte sind die Nachahmung von Standard-ELISA-Protokollen.

Der Assay kann auf gängigen Immunoassay-Geräten durchgeführt werden, ist mit klinischen Standardarbeitsabläufen kompatibel, erfordert keine Amplifikationsschritte und liefert Ergebnisse in weniger als drei Stunden, einschließlich miRNA-Profiling.

 

Erfahren Sie mehr über diese Quantifizierungsmethode in diesem YouTube Video.